[摘 要]通過對豬和雞組織樣品中的克侖特羅、鏈霉素等獸藥的檢測,比較了蛋白芯片檢測試劑盒、EL ISA檢測試劑盒和確證方法在獸藥殘留檢測中的應用。結果表明:蛋白芯片檢測試劑盒與EL ISA試劑盒性能相當,與確證方法的結果有很好的一致性,且具有同時檢測多種獸藥,前處理方法簡單、速度快等優(yōu)點。
[關鍵詞]生物芯片;蛋白芯片;多殘留檢測;樣品檢測
蛋白芯片獸藥殘留檢測試劑盒集成了樣品前處理及樣品檢測過程,該項技術是二十一世紀發(fā)展起來的一種新的食品中獸藥殘留量檢測技術。目前,該試劑盒可以實現(xiàn)對豬肉、豬肝、雞肉、雞肝4種組織以及豬尿中恩諾沙星、磺胺二甲嘧啶、鏈霉素、克侖特羅的半定量檢測,除具有靈敏度高、特異性強、樣品前處理簡單,檢測方便快速等優(yōu)點外,還可實現(xiàn)對上述多種獸藥同時并行檢測的優(yōu)點,極大地節(jié)省了檢測費用,縮短了檢測時間,進而提高了檢測效率。筆者利用蛋白芯片獸藥殘留檢測試劑盒對動物組織中幾種常用獸藥的殘留進行了檢測,并與其它方法進行了比較。
1 材料與方法
1. 1 材料
1. 1. 1 儀器與設備
芯片掃描儀,晶芯mEcoScan-100,北京博奧生物芯片有限公司; 均質器, JZ-Ⅱ型,中國鐵道部電化院四方電器設備廠;旋轉蒸發(fā)儀, RE252AA型, 上海亞榮生化儀器廠; 離心機,GL-20G-Ⅱ型,上海安亭科學儀器廠;酶標儀,MK3型,芬蘭Thermo; 氣相色譜2質譜聯(lián)用儀, TRACEDSQ,菲尼根;液相色譜儀,四元梯度泵配2695紫外檢測器和2475熒光檢測器,Waters公司;自動快速濃縮,DSY-Ⅱ型,北京金科精華苑技術研究所;多功能微生物自動測量分析儀, ZY2300Ⅳ,北京威鋒技術開發(fā)公司;恒溫培養(yǎng)箱, SGSP202型,黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司;旋渦混合器, TDX-1型,通達科技。固相萃取柱: C18 , 100 mg/mL,含碳量≥16 (用于恩諾沙星殘留分析) ; SupelcleanLC-C18 Sep pak 500 mg/3 mL 和SCX小柱LC-SCXSep pak 500 mg/3 mL,美國SUPELCO公司(用于GC-MS法分析克侖特羅殘留) ;RIDA C18 , 德國拜發(fā)公司。
1. 1. 2 EL ISA檢測試劑盒
克侖特羅殘留檢測試劑盒( 05073 ) 和磺胺二甲嘧啶殘留檢測試劑盒( EN5327) ,德國r2Biopharm公司;蛋白芯片獸藥殘留檢測試劑盒,批號20031202, 20040701,北京博奧生物芯片有限公司。
1. 1. 3 試藥與試劑
鏈霉素標準品,批號0308-200012,效價712單位/mg;鹽酸克侖特羅對照品,批號0072-8501,含量99. 6%;磺胺甲噁唑對照品,含量99. 0%;均由中國藥品生物制品檢定所提供。磺胺二甲嘧啶對照品,批號51K1523,含量99. 0%;磺胺甲氧噠嗪對照品,含量99%;磺胺二甲氧嘧啶對照品,含量99. 9%;磺胺甲氧嘧啶對照品,含量99%;磺胺喹噁啉對照品,含量97. 2%;沙丁胺醇對照品,含量99%;均購自美國Sigma公司。硫酸鏈霉素及雙氫鏈霉素對照品,含量≥99% , Fluka 公司;環(huán)丙沙星對照品,含量≥99% ,B iometical公司。恩諾沙星對照,批號H010102,含量100. 1% ,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。甲醇和乙腈,色譜純, Fisher公司。
1. 1. 4 實驗用菌和實驗動物
實驗菌為枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis) ,菌株號為CMCC63501,由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。實驗陽性動物為本所自己飼養(yǎng)添加藥物的10頭豬和29只雞(見表1) ,停藥2 d后屠宰取樣;陰性雞肉由實驗動物研究中心提供,陰性豬肉和肝超市采樣獲得;實驗樣品部分來自市場和屠宰廠。
1. 2 方法
1. 2. 1 蛋白芯片試劑盒靈敏度評價
1. 2. 1. 1 標準曲線溶液的配制：將各種藥物對照品(標準品)按實驗所需配制成標準溶液,詳見表2。
1. 2. 1. 2 芯片反應：操作方法按獸藥殘留蛋白芯片檢測試劑盒說明書進行。
1. 2. 1. 3 掃描及數(shù)據(jù)處理：芯片反應完畢后進行圖像掃描和數(shù)據(jù)處理,將校正后的熒光信號強度對各對照品(標準品)溶液藥物濃度作標準曲線,并求出每種藥物的IC50 (熒光信號強度下降一半的藥物濃度)值。
1. 2. 2 蛋白芯片試劑盒特異性評價
1. 2. 2. 1 標準曲線溶液的配制：將各種藥物對照品(標準品)按實驗所需配制成標準溶液,詳見表3、4、5、6。
1. 2. 2. 2 芯片反應：按獸藥殘留蛋白芯片檢測試劑盒說明書進行。
1. 2. 2. 3 掃描及數(shù)據(jù)處理：芯片反應完畢后進行圖像掃描及數(shù)據(jù)處理,將校正后的熒光信號強度對各對照品(標準品)溶液藥物濃度作標準曲線,并求出每種藥物的IC50值,再以芯片檢測目標藥物交叉反應率為100% ,按以下公式計算其它藥物(待測藥物B如磺胺喹噁啉等)與芯片檢測目標藥物(參考藥物A,如磺胺二甲嘧啶)之間的交叉反應率。
藥物B的交叉反應率=參考藥物A的IC50/待測藥物B的IC50 ×100%
1. 2. 3 樣品前處理
1. 2. 3. 1 蛋白芯片試劑盒：稱取5. 0 g粉碎后的樣品,放入離心管中,加入10. 0 mL組織樣品制備液,旋緊管蓋,用旋渦混合器劇烈混合2 min, 80 ℃水浴20 min,取出離心管,冷卻至室溫,以5 000r /min室溫離心10 min,然后吸取200μL的上清液轉移到1. 5 mL離心管中,加入800μL組織樣品稀釋液,蓋上管蓋,充分混合后即可用于檢測。
1. 2. 3. 2 磺胺二甲嘧啶殘留測定(EL ISA法) ：稱取5. 0 g粉碎后的樣品與20 mL乙腈水溶液(86 +16)混合10 min, 15 ℃以6 000 r/min離心10 min,取3 mL上清與3 mL蒸餾水混合,加入4. 5 mL醋酸乙酯混合10 min, 15 ℃以6 000 r/min離心10 min,將醋酸乙酯層轉移至另一瓶中*干燥,用1. 5 mL稀釋了的緩沖液溶解殘渣,加入1. 5 mL 正己烷混合5 min, 15 ℃以6 000 r/min離心10 min,*除去正己烷相,取50μL水相進行分析。
1. 2. 3. 3 磺胺二甲嘧啶殘留測定(HPLC法)按文獻[ 1 ]方法進行。
1. 2. 3. 4 鏈霉素殘留測定(微生物學法) [ 4 ]：稱取5. 0 g粉碎后的樣品,加入20 mL 磷酸緩沖液(pH 1. 5) ,勻漿后離心分離。取上清液用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8. 5,離心后取其上清液作為樣液。
1. 2. 3. 5 克侖特羅殘留測定(EL ISA法) ：按試劑盒說明書的方法進行。
1. 2. 3. 6 克侖特羅殘留測定( GC2MS法) ：按NY/QY468 - 2001方法進行[ 2 ] 。
1. 2. 3. 7 恩諾沙星殘留測定(HPLC法) ：按文獻[ 3 ]方法進行。
1. 2. 4 樣品測定：蛋白芯片獸藥殘留檢測方法,按獸藥殘留蛋白芯片檢測試劑盒使用說明書進行;EL ISA法測定, 按磺胺二甲基嘧啶、克侖特羅的EL ISA檢測試劑盒操作說明進行;磺胺二甲基嘧啶和恩諾沙星殘留檢測的液相色譜法分別按文獻[ 1, 3 ]方法進行;鏈霉素在動物組織中殘留的微生物學檢測方法,按文獻[ 4 ]進行;豬尿中克倫特羅的(GC2MS)檢測方法按文獻[ 5 ]進行;動物組織中克侖特羅的測定(GC2MS) ,按參考文獻[ 2 ]進行。
2 結果
2. 1 蛋白芯片試劑盒指標測試結果：本實驗對用于獸藥殘留檢測的蛋白芯片相關指標進行了初步研究,各項指標測試結果見表7、8。
2. 2 蛋白芯片試劑盒與其他檢測方法樣品檢測結果比較：相同的樣品用蛋白芯片試劑盒檢測后,再用EL ISA試劑盒、抗生素微生物檢定法、HPLC法和GC - MS法等方法進行了測定,依據(jù)農(nóng)業(yè)部第235號文件中的獸藥zui高殘留*[ 6 ]判定樣品中的獸藥殘留是否超標。結果如表9所示。
3 討論
3. 1 從1. 2. 1中可以看出,用蛋白芯片進行獸藥殘留檢測的樣品前處理方法簡單、速度快,且用同一種方法提取了多種獸藥,減少了樣品前處理時間(與其它方法比較情況見表10) 。
3. 2 從表9得出,在對102份樣品的檢測中,其他方法檢測的陽性樣品數(shù)為38,而蛋白芯片試劑盒檢測的陽性樣品數(shù)為40,兩者有很好的符合率。用EL ISA試劑盒共檢測了58份樣品,其中陽性樣品22份,而蛋白芯片試劑盒檢測的陽性樣品為20份,兩者的符合率也較好。以上結果說明蛋白芯片試劑盒結果可靠。
3. 3 與其他方法相比,蛋白芯片試劑盒具有并行處理的能力,在一張芯片上可同時檢測2種以上的獸藥,目前的蛋白芯片試劑盒可同時檢測磺胺二甲基嘧啶、克侖特羅、鏈霉素和恩諾沙星,可根據(jù)需要在一張芯片上檢測多種獸藥。
4 結論
生物芯片用于獸藥殘留檢測具有可同時檢測多種獸藥、準確性高、前處理簡單、速度快等優(yōu)點。
目前用于獸藥殘留檢測的生物芯片正處于發(fā)展的初期,可檢測的獸藥種類相對較少,但初步實現(xiàn)了多殘留檢測,顯示出生物芯片的并行性和高通量性,且生物芯片容易實現(xiàn)集成化和自動化,在獸藥殘留的自動化檢測上具有一定的優(yōu)勢。本實驗是國內(nèi)外使用生物芯片對獸藥殘留進行檢測。
